La fuerte resistencia ofrecida por los habitantes indígenas de la religión hizo difícil el avance de los conquistadores. En 1536, al frente de una expedición que se dirigía a Chile, anduvo por la puna jujeña Diego de Almagro, compañero de aventuras y socio de Pizarro en el Perú. la muerte en combate de varios de sus hombres lo obligó a apurar el paso por la quebrada de Escoipe y llegar al valle de Lerma, donde, tras reponerse, siguió rumbo a Chile, por la Sierra Nevada. Siete años después, aunque procedente del sur, el capitán Diego de Rojas recorrió el mismo camino, pero con peor fortuna: en la quebrana de Humahuaca fue muerto por los indios y su cabeza terminó coronando una lanza guerrera.Los tiempos que siguieron no fueron más fáciles. En 1563, los ataques indios obligaron a los españoles a abandonar la ciudad de Nieva, fundada dos años antes por Gregorio Castañeda cercana de la actual San Salvador de Jujuy. Algo similar ocurrió con la ciudad levantada en 1575 por Pedro de Zárate, San Francisco de Álava, que fue arrasada.
Pese a todo, incluso a los enfrentamientos existentes entre los mismos españoles, la superioridad militar de los conquistadores terminó por imponerse: trs el emplazamiento de tres fuerte- el de Hernán Gómez, el Grande y el de Palpalá- entre el acceso a la quebrada de Humahuaca y el valle que, desde hacía medio siglo, los españoles ya llamaban de Xuxuy o Jujuy, el 19 de abril de 1593, Francisco de Argañaraz y Murquía fundó San Salvador de Velazco en el Valle de Jujuy, la actual capital de la provincia. Vencido Vilipoco, el último gran cacique de los omaguacas, se consolidó definitivamente el poder de la Corona.
